PEWARNAAN MIKROBA

02.40 |

(Laporan Praktikum Mikrobiologi Pertanian)

Oleh:

Eldineri Zulkarnain

1214121073

LABORATORIUM HAMA DAN PENTAKIT TANAMAN

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS LAMPUNG

2013

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri merupakan organisme mikroskopis. Bakteri berasal dari bahasa Yunani yaitu Bakterion yang berarti batang kecil. Ciri-ciri umum bakteri yaitu tubuh uniseluler, tidak berklorofil, bereproduksi dengan membelah diri, habitatnya dimana-mana (tanah, air, udara, dan makhluk hidup), diameternya 0.1-0.2 um, bakteri aktif bergerak pada kondisi lembab. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil, kokus, dan spirilum. Dengan adanya perbedaan bentuk-bentuk tersebut dapat menunjukkan karakteristik spesies bakteri, tetapi tergantung pada kondisi pertumbuhan.Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop.

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan

pewarna asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lainPewarnaan gram merupakan pewarnaan umum dalam bidang bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif . Hasil akhir dari pewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu/biru,sementara bakteri gram negatif akan berwarna merah.

1.2 Tujuan Percobaan

Adapun tujuan percobaan yang dilakukan kali ini adalah untuk :

Untuk mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya, dan mengamati ciri-ciri tertentu mikroba

II. PROSEDUR PERCOBAAN

2.1 Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah jarum ose, kaca preparat, bunsen, pipet tetes, mikroskop rak tabung reaksi, dan tabung reaksi. Sedangkan bahan yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah safranin, iodium, kristal violet, biakan mikroba, alkohol, aquades dan bakteri Pseudomonas florence..

2.2 Prosedur Kerja

Adapun cara kerja dalam praktikum kali ini adalah sebagai berikut:

2.2.1 Pewarnaan Sederhana

1. Melakukan pengenceran bakteri Pseudomonas florence hingga pengenceran 10^-2.

2. Hasil pengenceran tersebut diambil dengan menggunakan jarum ose dan diletakkan dalam kaca preparat.

3. Kemudian melakukan fiksasi 2-3 kali diatas bunsen sampai hangat dan agak kering.

4. Meneteskan larutan safranin dengan menggunakan pipet tetes kedalam kaca preparat tersebut.

5. Kemudian mengfiksasi kembali sampai kering dan kemudian dibilas dengan aquades lali dilap dengan tisue.

6. Mengamati dibawah mikroskop.

2.2.2 Pewarnaan Gram

1. Melakukan pengenceran bakteri Pseudomonas florence hingga pengenceran 10^-²

2. Hasil pengenceran tersebut diambil dengan menggunakan jarum ose dan diletakkan dalam kaca preparat.

3. Kemudian melakukan fiksasi 2-3 kali diatas bunsen sampai hangat dan agak kering.

4. Meneteskan satu tetes larutan kristal violet kemudian didiamkan 1-2 menit,kemudian membilas dengan air mengalir.

5. Setelah itu meneteskan satu tetes larutan iodium kemudian didiamkan 1-2 menit setelah itu dibilas dengan air mengalir,kemudian dibersihkan dengan alkohol 96%.

6. Meneteskan satu tetes larutan safranin kemudian didiamkan 1-2 menit,setelah itu dibilas dengan air mengalir. Apabila hasil akhir berwarna biru maka gram positif dan apabila berwarna merah berarti gram negatif.

III. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan

Adapun hasil pengamatan dari percobaan ini adalah:

No.	Gambar	Keterangan
1.		Pewarnaan Sederhana
2.		Perwanaan Gram

3.2 Pembahasan

Pada praktikum kali ini bertujuan agar praktikan terampil dalam melakukan pewarnaan gram dan pewarnaan sederhana, dan mempelajari teknik pewarnaan gram an sederhana untuk mempermudah mengidentifikasi pengamatan mikroba.

Pewarnaan sederhana bertujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri bakteri. Prinsip pewarnaan sederhana adalah bakteri diwarnai oleh reagen tunggal. Pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan,selama asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen. Penting diperhatikan lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarna yang digunakan.

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka air dan basa). Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, safranin dan karbol fuehsin.

Pewarnaan Gram (atau's metode Gram) adalah sebuah metode empiris yang membedakan bakteri spesies ke dalam dua kelompok besar ( Gram-positif dan Gram-negatif ) berdasarkan kimia dan sifat fisik mereka dinding sel . Noda Gram hampir selalu merupakan langkah pertama dalam identifikasi organisme bakteri. Sedangkan pewarnaan Gram adalah alat diagnostik berharga dalam penelitian kedua pengaturan. Tidak semua bakteri klinis dan dapat secara definitif diklasifikasikan dengan teknik ini, sehingga membentuk variabel Gram dan Gram indeterminant kelompok juga.

Pewarnaan Gram merupakan pemisahan dari semua bakteri menjadi dua kelompok besar, yang mempertahankan zat warna primer (gram-positif) dan yang mengambil warna counterstain (gram-negatif). Pewarna utama adalah kristal violet dan sekunder pewarna biasanya baik safranin O atau dasar fuchsin. Beberapa lebih umum meliputi: jenuh ungu kristal (sekitar 1%), Ungu dan 2% alkohol violet kristal Kristal.

Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010).

Ciri – Ciri bakteri gram positif

1. Struktur dinding sel tebal (15 – 80 nm) dan berlapis tunggal.

2. Komposisi kimiawi : kandungan lipid rendah (1 - 4 %), peptidoglikan lapis tunggal (>50%), asam tekoat.

3. Kerentanan terhadap penisilin→ lebih rentan (peka).

4. Pertumbuhan dihambat oleh zat-zat warna dasar (misal ungu kristal)

5. Persyarataan nutrisi → relatif rumit pada banyak spesies.

6. Resistensi terhadap gangguan fisik→ lebih resisten (tahan).

7. Reaksi terhadap pewarna primer atau ungu kristal iodium → dapat menahan sampai akhir prosedur (sel tampak biru gelap/ungu).

Ciri-ciri bakteri gram negatif

1. Dinding sel tipis (10-15 nm) berlapis tiga (multi).

2. Kandungan lipid tinggi : peptidoglikan (10% berat kering), tidak ada asam tekoat.

3. Kerentanan terhadap penisilin kurang rentan.

4. Pertumbuhan tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar.

5. Persyaratan nutrisi → relatif sederhana.

6. Resistensi terhadap gangguan fisik→ kurang resisten

7. Kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu dicuci alkohol → terwarnai pewarna tandingan safranin (sel tampak merah muda).

Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Faktor – faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba ialah:

1. Fiksasi

Fiksasi dilakukan sebelum zat warna digunakan, bertujuan untuk:

1. Melekatkan sel pada gelas objek.

2. Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada sel dalam keadaan hidup.

3. Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif-NH₃ yang akan bereaksi dengan gugus OH^- dari zat warna.

4. Mencegah terjadinya otolitis sel, yaitu proses pecahnya sel yang disebabkan oleh enzim yang ada didalamnya.

5. Merubah daya ikat zat warna.

Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun pengeringan secara dingin, sedangkan yang paling umum dilakukan secara kimia dengan penambahan sabun, formalin, fenol, dan sebagainya.

2. Pelunturan warna

Pelunturan warna bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga dengan jelas dapat dilihat dibawah mikroskop misalnya.

Pada umumnya sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan, sedangkan sebaliknya sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk dilunturkan. Sifat cepat dan lambatnya cara pelunturan inilah yang diperbedakan untuk membedakan kelompok mikroba setelah diberi pewarnaan.

Dari segi ketahanan sel terhadap senyawa kimia, dibidang mikrobiologi dikeSnal ada tahan asam, tahan alkohol, tahan air dan sebagainya. Ketahanan terhadap suatu zat kimia inipun dipergunakan untuk membedakan kelompok mikroba.

IV. KESIMPULAN

Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat ditarik beberapa kesimpulan yang perlu kita pahami sebagai berikut :

1. Pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.

2. Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum.

3. Pewarnaan Gram merupakan pemisahan dari semua bakteri menjadi dua kelompok besar, yang mempertahankan zat warna primer (gram-positif) dan yang mengambil warna counterstain (gram-negatif).

4. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu/ biru.

5. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.